陈文祥、李姿芸、杨睿悦等：液相色谱串联质谱法检测血清他汀及其活性代谢物浓度办法的树立与临床运用

　　原标题：陈文祥、李姿芸、杨睿悦等：液相色谱串联质谱法检测血清他汀及其活性代谢物浓度办法的树立与临床运用

　　本文刊载于《临床试验室》杂志2023年5月刊“质谱检测技能临床运用”专题-「试验室确诊技能导航」版块

　　李姿芸 王欣越 于雪 王思明 李红霞 牟洪娜 赵香慧 董军 陈文祥 杨睿悦

　　北京医院国家晚年医学中心，国家卫生健康委北京晚年医学研讨所，国家卫生健康委晚年医学要点试验室，中国医学科学院晚年医学研讨院(李姿芸 王思明 李红霞 牟洪娜 赵香慧 董军 陈文祥 杨睿悦)；北京医院心血管内科国家晚年医学中心，中国医学科学院晚年医学研讨院 (王欣越 于雪)；北京医院国家晚年医学中心，国家卫生健康委临床查验中心，中国医学科学院晚年医学研讨院(陈文祥)

　　依据液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），树立一种牢靠、简略、高效的检测血清瑞舒伐他汀（RSV）、匹伐他汀（PIV）、阿托伐他汀（AT）、阿托伐他汀的活性代谢物2-羟基阿托伐他汀（2-AT）和4-羟基阿托伐他汀（4-AT）浓度的剖析办法，并内行冠脉造影人群中进行开始临床运用。

　　以d5-AT、d5-2-AT、d5-4-AT、d3-RSV、d4-PIV为同位素内标，乙酸铵缓冲溶液调理血清pH值后，参加乙酸乙酯液液萃取。离心后汲取上层溶液、吹干、活动相重组、经液相别离后，选用正离子多反响监测办法进行串联质谱检测。查询办法的特异性、线性、检测限 (LOD)、定量限 (LOD)、精细度、回收率、基质效应和样本安稳性。搜集100名服用AT、RSV或PIV进行调脂医治的行冠脉造影患者血清，测定上述五种他汀及活性代谢物浓度，剖析他汀服用剂量与浓度的联系。

　　本办法特异性杰出，在待测物保存时间内无搅扰峰；待测物的检测限均低于0.05 ng/ml；AT、2-AT、4-AT、RSV在0.1~40 ng/ml 浓度规模内体现杰出的线 ng/ml；PIV在0.25~100 ng/ml浓度规模内体现杰出的线 ng/ml；批内不精细度和批间不精细度均小于7.7%；加标回收率规模为97.7%~106.9%；无显着基质效应；样本在室温放置3h、4℃放置24h、-80℃放置30天以及重复冻融3次后保持安稳，经前处理后的样本室温或4℃放置24小时后仍能保持安稳。检测100名行冠脉造影患者血清他汀及代谢物水平，五种待测物的浓度均在线性规模内;Jonckheere-Terpstra趋势查验成果显现，AT、2-AT和4-AT的浓度均跟着服药剂量添加而上升（Z=2.849, P=0.004; Z=3.174, P=0.002; Z=2.767, P=0.006）。

　　树立的测定血清中AT、2-AT、4-AT、RSV和PIV浓度的HPLC-MS/MS办法简洁、活络、牢靠，有望为他汀类药物浓度监测、单个化用药辅导及进一步的临床研讨供给有用技能手段。

　　心血管疾病已经成为人类健康的头号杀手。流行病学研讨显现，我国动脉粥样硬化性心血管病（Cardiovascular disease，CVD）的产生率和逝世率逐年上升，疾病担负日益加剧。血脂异常是导致CVD产生的主要原因之一。他汀类药物能够显着削减体内胆固醇的生物组成，下降血脂水平，还具有安稳动脉粥样硬化斑块，抗炎症反响，改进内皮细胞功用，按捺血栓构成等功用，然后发挥抗CVD作用，广泛运用于CVD的防备和医治。

　　因为遗传布景差异、依从性、药物联用等要素，他汀类药物的安全性和作用在单个患者中存在显着差异。例如，患者承受他汀医治时，呈现血药浓度过低或过高，导致降脂作用不抱负和严峻不良反响（如横纹肌溶解、肝损害等）的产生。因而，对服用他汀类药物的患者进行医治药物监测（Therapeutic drug monitoring，TDM），实施单个化用药，对进步药物医治作用尤为重要。此外，在CVD的流行病学研讨中，经过查询服药史对他汀的露出水平进行点评，简略引进许多偏倚，也无法很好地点评他汀体内代谢产品的浓度。而测定他汀及代谢物的体内浓度，能够直接反映其露出水平，在CVD的流行病学研讨中具有重要含义。

　　现在，文献报导测定他汀类药物及其代谢物的剖析办法主要有酶按捺法、HPLC、GC-MS、LC-MS、LC-MS/MS等，酶按捺法，进程繁琐、耗时长，活络度低；HPLC法多用于测定单种他汀，检测多种他汀时活络度较低；GC-MS法需求进行衍生化预处理；LC-MS/MS法活络牢靠，可是现有办法大多只能测定单一他汀及其代谢物，仅有少量可一起检测多种他汀及代谢物。而一起检测多种他汀的LC-MS/MS办法，存在活络度较差、耗时长、操作杂乱、较难完成高通量检测等问题。因而，本研讨旨在树立一种特异活络、简略精确，可一起测定瑞舒伐他汀（Rosuvastatin，RSV）、匹伐他汀（Pitavastatin，PIV）、阿托伐他汀（Atorvastatin ，AT）及其活性代谢产品2-羟基阿托伐他汀（Ortho-hydroxy atorvastatin，2-AT）和4-羟基阿托伐他汀（Para-hydroxy atorvastatin,4-AT）血药浓度的LC-MS/MS剖析办法，为他汀类药物的TDM、单个化用药辅导及CVD流行病学研讨供给技能渠道。

　　搜集北京医院心内科住院并行冠状动脉造影100名患者（男性57名，女人43名）的空腹静脉血于线 ml冻存管内，-80 ℃条件下保存。本研讨经北京医院道德委员会审阅同意（编号：2016BJYYEC-121-02），研讨目标均签署了知情同意书。

　　将5种待测物和5种内标别离溶于乙腈溶液，制形成1 mg/ml的储藏液。精细汲取储藏液，以乙腈为溶剂进行稀释，别离制造混合规范工作液和混合内标工作液（d5-AT、d5-2-AT、d5-4-AT、d3-RSV浓度为200 ng/ml , d4-PIV浓度为500 ng/ml），分装、密封后在-80℃条件下保存。用不含他汀的空白血清稀释混合规范工作液至相应的浓度得到规范样品（Standard samples，STD）和质控样品（Quality control, QC）。制造极低浓度、低、中、高四个浓度的QC，其间AT、2-AT、4-AT、RSV浓度为0.1、1.0、8.0、32.0 ng/ml，PIV浓度为0.25、2.5、20.0、80.0 ng/ml。

　　办法学点评参阅CLSI C62-A和《液相色谱-质谱临床运用主张》等攻略，包含对办法的特异性、线性、检测限和定量限、不精细度、加标回收率、基质效应、安稳性等方面的查询。

　　（1）特异性点评：搜集6份未服用他汀类药物的单个空白血清进行试验，查询人体血清中的内源物质是否会对待测物和内标的测定形成搅扰。空白血清和加标血清经过前处理后，进样剖析，调查各待测物和内标剖析时间内是否有杂质峰搅扰。

　　（2）线性、检测限和定量限点评：以待测物的浓度作为横坐标，待测物峰面积与内标峰面积的比值作为纵坐标，制作规范曲线/x加权后进行回归剖析后得到线性回归方程和相联系数r。信噪比（Signal-to-noise ratio，S/N）≥3时的浓度定为检测限（Limit of detection，LOD），S/N≥10时的浓度定为定量限（Limit of quantitation，LOQ）。

　　（3）不精细度点评：用所建办法接连3天测定3批极低、低、中、高4个浓度的QC样本，每个浓度QC各设置6个平行管，核算批内、批间不精细度。

　　（4）加标回收率点评：用所建办法检测极低、低、中、高4个浓度的QC样本，每个浓度检测6次，核算加标回收率。加标回收率核算办法：加标回收率（%）=实测浓度待测物/理论浓度待测物´´100%；理论浓度为实践添加待测物的浓度。

　　（5）基质效应点评：6份不同单个的空白血清经前处理后，用含有待测物和内标的活动相复溶，进样剖析，待测物和内标的峰面积别离记为A1和A2。另取超纯水经相同处理，进样剖析，待测物和内标的峰面积别离记为B1和B2。基质因子（Matrix factor，MF）核算公式如下：MF待测物=A1/B1， MF内标=A2/B2。经内标校对的基质效应（Matrix effect，ME）的核算公式为：ME=MF待测物/MF内标×100%。

　　（6）安稳性查询：为查询在不同贮存条件下血清样本中待测物的安稳性，将4个浓度的QC样本别离放置在室温（3h）、4℃（24h）、-80℃（30 day）条件下和重复冻融3次处理后，进行浓度测定。为查询经前处理后的样本安稳性，将4个浓度的QC样本经前处理后在室温（24h）、4℃（48h）条件下保存后，再进行浓度测定。

　　五种待测物在低、中、高3个水平浓度的批内CV均在0.2%~6.1%，总CV均在1.5%~5.1%；在极低浓度水平的批内CV均在1.8%~7.6%，总CV均在4.9%~7.7%，详细成果见表2。

　　五种待测物在低、中、高浓度水平的加标回收率为100.7%~107.0%；在极低浓度水平的加标回收率别离为97.7%~103.5%，加标回收率成果见表3。

　　运用6份不同单个的空白血清，查询在高、低两个浓度水平下的基质效应。五种待测物经内标校对的基质效应见表4，经内标校对后的基质效应均在97.1%~101.5%，CV均小于4.1%，无显着基质效应。

　　4个水平（极低浓度、低、中、高）的QC样本经过室温放置3h，4℃放置24h，-80℃放置30天，重复冻融3次处理后，均能保持安稳，测定浓度为初始浓度的94.5%~106.3%。样本经过前处理后，在室温放置24h（25℃）、4℃放置48h后均能保持安稳，测定浓度为初始浓度的91.0%~107.5%。

　　经过已树立的LC-MS/MS办法检测服用他汀类药物（AT、RSV、PIV）的100名行冠脉造影者血清，他汀及代谢物浓度散布如图3所示。其间，服用AT的患者共有39名，每天的剂量为10mg（n=14）、20mg（n=16）和40mg（n=8）；服用RSV的患者共有35名，每天服药剂量为10mg（n=29）和20mg（n=5）；服用PIV的患者共有26名，每天服药剂量为1mg（n=2）和2mg（n=6），其他患者服药剂量不清晰。对他汀及其活性代谢物的血清浓度与剂量进行Jonckheere-Terpstra趋势查验剖析，成果如图4所示。=0.006）。因为服用20 mg的RSV和清晰服用PIV详细剂量的样本量较少，不同剂量组间的他汀浓度差异无统计学含义。

　　图3 LC-MS/MS测定100名行冠状动脉造影者血清中的AT、RSV、PIV及其代谢物水平

　　注：图A-C 别离为服用不同剂量AT的行冠状动脉造影者血清中AT、2-AT、4-AT的浓度水平；多组间验选用Jonckheere-Terpstra趋势查验

　　阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀是临床上常用的他汀类药物。这些药物的运用在下降心血管疾病产生率和逝世率方面发挥了重要作用。国内外研讨显现，他汀类药物调脂医治中存在患者依从性差等问题，这可能会导致血药浓度过低，医治作用不抱负。此外，患者的合并症、遗传多态性、药-药彼此作用等要素也会导致其血药浓度过高，然后导致他汀相关性肌病等不良反响的产生。TDM能够供给患者服药和他汀反响状况等信息，协助医师依据患者实践状况拟定单个化给药计划，进步药物作用，防止毒副反响的产生。在CVD流行病学研讨中，经过自我陈述/问卷查询的办法获取患者服药的品种和剂量，简略呈现药物数据缺失，或引进回忆偏倚，也无法反映体内他汀代谢物的水平。而测定体内他汀和代谢物的浓度，能够协助快速获取服药品种、剂量、血药浓度等信息，削减偏倚和药物数据缺失，在流行病学研讨中也具有重要含义和运用远景。

　　他汀类药物以羟基酸的办法发挥药理活性，AT、RSV和PIV都是以活性办法给药，AT的代谢物2-AT和4-AT相同具有降脂活性，且在AT医治进程中，大部分降脂活性由这两种活性代谢物供给。研讨发现，他汀相关肌病患者体内4-AT的浓度显着高于健康人群。行列研讨标明，4-AT的体内浓度与逝世危险添加独立相关，提示4-AT可能是猜测心血管结局的标志物。因而，对他汀原型药物及其活性办法的血药浓度监测能够客观地反映其降脂作用，辅佐点评医治进程中不良反响和心血管事情的危险。

　　他汀类药物的结构主要由含替代基的疏水性环状结构和药效基团（二羟基庚酸片段或其内酯办法）一起组成，疏水环及其环上替代基的品种决议了他汀类药物在极性、溶解性等方面的差异。例如，瑞舒伐他汀因其疏水环上替代水溶性的甲磺酰氨基而呈较强的亲水性，匹伐他汀因其环上替代基为脂溶性的三元环和氟代苯环而呈强亲脂性。此外，他汀类药物的羟基酸办法与内酯办法之间能够彼此转化，该进程受温度、pH值等要素的影响。他汀类药物的理化性质差异和酸-内酯转化进程，给其精确剖析定量带来了较大难度。

　　现在，已报导许多用于药代动力学研讨和等效性研讨的定量测定血样中他汀类药物及其代谢物浓度的LC-MS/MS办法，但大多只能测定单一他汀及其代谢物，仅有单个可一起检测多种他汀及代谢物。在已报导的测定单种他汀及其代谢物的办法中，前处理环节所需样本的体积较大（200-1000 ml），选用的固相萃取法进程杂乱，本钱高。咱们树立的办法所需的血清体积仅为100 ml，挑选乙酸乙酯进行液液萃取，操作更简略，本钱更低，呼应基线低，且无杂质峰搅扰。一起，据文献报导，前处理进程中，将pH值控制在4.0~5.0之间能够按捺他汀羟基酸与内酯办法之间的转化，而咱们选用乙酸铵溶液调理血清的pH值至4.0~4.5，确保了他汀的精确定量。

　　测定单种他汀及其代谢物的剖析办法的LOQ（0.05 ng/ml）较低，但本办法具有一起定量三种他汀及其活性代谢物的优势，防止人工区别服用不同他汀的血样，可完成高通量检测。在已报导的一起定量测定多种他汀及代谢物的研讨中，为将同分异构体别离都选用梯度洗脱办法，剖析运转周期长（11-12 min），且活络度较差，部分办法的基质效应显着。本研讨选用的五氟苯基柱对他汀具有杰出的保存和挑选性，选用等度洗脱的办法便可完成对羟基替代在苯环邻位和对位的两种羟基阿托伐他汀的基线别离，这大大缩短了剖析运转周期（6 min），进步检测功率。本研讨的基质效应挨近100%，且CV5%,标明待测物对应的安稳同位素氘代内标的运用有用校对了基质效应，进步了办法的精确度和精细度。本试验的批间和批内精细度均小于8%，待测物的加标回收率均在100%左右，LOQ可达ng/ml级（0.1ng/ml和0.25ng/ml），剖析办法安稳，精确度高，活络度较高，能够满意流行病学筛查和医治药物监测的临床运用的需求。

　　运用所树立的LC-MS/MS办法检测100名行冠状动脉造影者的血清，检测到的他汀品种均与患者病例中所陈述的共同。在同一剂量下，患者血清他汀及其代谢物浓度相差较大，阐明不同单个对剂量反响存在较大差异，这很有可能会形成调脂作用欠安，乃至呈现严峻的毒副作用和不良反响。对服用他汀类药物的患者进行他汀和代谢物浓度监测，能够协助及时调整给药计划，进步药物医治的安全性和有用性。趋势查验成果显现，AT及其活性代谢物2-AT、4-AT的血清浓度跟着剂量添加而升高，阐明其血清浓度能够必定程度上反映AT的露出水平。不同剂量组的RSV和PIV样本量较少，下一步应扩展样本量进行验证。

　　综上，本研讨树立了一种简易、活络、牢靠的LC-MS/MS办法，运用于服用阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀药物人群的血药浓度监测，客观地反映他汀类药物的露出剂量，有望为TDM、单个化用药辅导及CVD流行病学研讨供给技能手段。