成都中医药大学：根据NLRP3细胞焦亡通路研讨荆芥挥发油的抗郁闷效果及效果机制

　　郁闷症是一种常见的精神疾病，以显着而耐久的心情失落为首要临床特征，首要体现有心境失落、毅力活动减退、思想迟平缓认知功用危害，一起伴有睡觉妨碍、焦虑，甚者出现严峻的自残或自杀行为 [1] 。郁闷症 的病因和发病机制杂乱，且没有彻底阐明。现在以为中枢神经炎症是郁闷症发病的中心机制之一，机体长时间露出于高水平的炎性细胞因子可诱发神经体系的病变，然后或许导致郁闷妨碍等神经精神疾病的产生 [2] ，体现为炎症因子能促进活性氧自在基生成，直接损害与郁闷症发病相关的脑区神经元和胶质细胞，打乱神经内排泄功用，引起郁闷症相关的各种症状 [3-4] 。临床研讨发现，郁闷症患者外周血中的白细胞 介素 -1β （ interleukin-1β ， IL-1β ）、 IL-6 和肿瘤坏死因子 -α （ tumor necrosis factor-α ， TNF-α ）等细胞因子水平显着升高，运用抗郁闷药医治后，上述促炎细胞因子的水平显着下降 [5] 。活化的神经小胶质细胞会产生很多炎症介质， 诱导神经炎症和认知妨碍 [6] ，其机制触及炎症反响产生亲近相关的 NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白 3 （ NOD-like receptor pyrin domain containing 3 ， NLRP3 ）炎性小体激活， NLRP3 炎性小体存在于中枢神经体系的小胶质细胞和星形胶质细胞中 [7] ，激活后开释炎症因子并发动下流炎症反响 [8] ，诱发的神经炎症参加神经损害，可导致疾病和郁闷样行为。

　　荆芥 Schizonepeta tenuifolia Briq . 挥发油及其首要成分胡薄荷酮、薄荷酮具有杰出的抗炎效果，能够减轻炎性损害 [9] 。左旋薄荷酮还能按捺下丘脑 - 垂体 - 肾上腺（ hypothalamic-pituitary-adrenocortical ， HPA ）轴过度活化，促进皮质脑源性神经养分因子（ brain-derived neurotrophic factor ， BDNF ）的表达，然后发挥抗郁闷效果 [10] 。课题组前期研讨标明，荆芥挥发油的杰出抗炎效应与按捺 NLRP3 炎症小体激活有关 [11] ，一起发现荆芥挥发油经过减轻神经炎症反响对脂多糖（ lipopolysaccharides ， LPS ）诱导的郁闷样模型小鼠发挥维护效果 [12] 。根据前期研讨根底，结合现在中药挥发油的中枢神经体系效果的知道 [13] ，本研讨选用缓慢温文不行预知应激（ chronic unpredictable mild stress ， CUMS ）诱导的小鼠郁闷样模型，展开荆芥挥发油的抗郁闷效果及 NLRP3/ 细胞焦亡通路效果机制研讨，为进一步探求荆芥挥发油的抗郁闷效果及临床运用拓宽供给试验根据。

　　SPF 级雄性 ICR 小鼠， 5 周龄，体质量 18 ～ 20 g ， 购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，合格证号 SCXK （京） 2019-0010 。一切动物均自在饮食饮水，在 24 h 明暗周期的环境中养殖，昼夜各 12 h ，温度（ 25 ± 1 ）℃，相对湿度 40% ～ 60% 。本试验契合动物试验道德学规范，取得成都中医药大学试验动物道德委员会的同意（同意号 20200320 ）。

　　荆芥穗 S. tenuifolia Briq . 购自太极大药房，批号 20210101 ，经成都中医药大学判定教研室严铸云教授判定契合《我国药典》 2020 年版要求。

　　UPK-10T 型纯水仪（广州市优普科技有限公司）； BS323S 型电子天平（德国 Sartorius 公司）； 3001 型酶标仪、 ST16R 型冷冻离心机、 Revos 型脱水机（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）； DYY-6C 型电泳仪电源（北京市六一仪器厂）； 1658000 型小型笔直电泳槽、转膜槽、 ChemiDoc 型免染型化学发光凝胶成像体系（美国 Bio-Rad 公司）； JB-P5 型包埋机、 JB-L5 型冻台（武汉豪杰电子有限公司）； RM2016 型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）； KD-P 型安排摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）； GFL-230 型烤箱（天津市莱玻瑞仪器设备有限公司）； Eclipse E100 型正置光学显微镜、 DS-U3 型成像体系（日本尼康公司）。

　　荆芥穗打粉，以 6 倍量水浸泡 30 min 后，水蒸气蒸馏法提取挥发油，大火煮沸后微火加热至无挥发油生成中止，搜集挥发油提取器中上层挥发油，无水硫酸钠脱水后避光保存， 1 kg 生药经提取得到 9 mL 荆芥挥发油。 荆芥挥发油经 GC-MS 检测，其首要成分有胡薄荷酮、异薄荷酮、薄荷酮及胡椒酮等，相对质量分数别离为 36.76% 、 14.39% 、 14.39% 、 2.73%[12] 。

　　小鼠习惯性养殖 3 d 后，按体质量分层随机分为对照组和造模组，对照组小鼠合笼养殖不施加造模程序，造模组小鼠单笼养殖，并施加 CUMS 程序进行造模：冷水游水（ 4 ℃、 5 min ），空笼，夹尾（ 3 min ），频闪灯影响（ 12 h ），明暗倒置，禁食 24 h ，禁水 24 h ，湿润垫料（ 12 h ），异味影响（ 3 h ），捆绑（ 3 h ），鼠笼歪斜，噪音环境（ 60 Hz ， 1 h ），将以上影响因子随机分配，每日安排 2 种单因子影响或复合因子影响，相邻 2 d 影响因子不重复，使动物不能意料影响的产生。给药期间造模程序不中止。 造模前及开端造模后每周测定小鼠糖水偏好率，接连造模 6 周后，与对照组比较模型组小鼠糖水偏好率出现显着下降，提示造模成功。随后根据小鼠糖水偏好率，将造模组小鼠从头分组，使各组糖水偏好率附近且与对照组比较均有显着性差异，分为模型组、 FLX （ 10 mg/kg ，相当于成人临床日用剂量的 30 倍）组和荆芥挥发油高、低剂量（ 100 、 50 mg/kg ，别离为 1/5 LD50 、 1/10 LD50 ）组，每组 10 只，其间荆芥挥发油的剂量设置参阅其急性毒性 试验成果及以往研讨根底 [12] 。各给药组 ig 相应药物（ 20 mL/kg ），对照组和模型 组 ig 等体积蒸馏水， 1 次 /d ，接连给药 5 周 。

　　2.3.1糖水偏好 试验 糖水偏好 试验前，各组小鼠给予 1 瓶白水与 1 瓶 1% 蔗糖水饮用，习惯一边白水、一边蔗糖水的状况。习惯 12 h 后，一切小鼠单笼养殖，禁食禁水 12 h 。每只小鼠各给予 1 瓶白水与 1 瓶 1% 蔗糖水，称定 2 只水瓶质量。在小鼠饮用白水或蔗糖水 12 h 后，取下水瓶，再次称定水瓶质量，以 2 次水瓶质量差值记为小鼠白水或蔗糖水的耗费量，核算小鼠糖水偏好率。造模前测定小鼠糖水偏好率根底值，造模开端后于每周固定时间测定小鼠糖水偏好率 1 次。

　　2.3.2逼迫游水、悬尾 试验 参阅文献办法 [14-15] ，各组小鼠于处理前 1 周进行试验。

　　（1）逼迫游水试验：在高 30 cm 、直径 20 cm 的圆柱型通明器皿中注入 20 cm 深清水，温度（ 25 ± 2 ）℃。将小鼠置于器皿内，计时 6 min ，前 2 min 使其习惯性游水，记载后 4 min 内累积不动时间。

　　（2）悬尾试验：将小鼠尾部后 2 cm 处用胶带固定在水平方位，使其呈倒挂状况，头部离下水平面 5 ～ 6 cm ，记载动物在 6 min 内后 4 min 的累积不动时间。

　　2.3.3飞溅 试验 将 10% 的蔗糖水接连 3 次喷于小鼠背部接近尾端处。之后放入小鼠本来寓居的笼中记载 5 min 内小鼠的梳洗时间（小鼠梳洗背部喷洒糖水方位的行为时间记为梳洗时间），于选材前 1 周进行测定。

　　行为学测验结束后，小鼠眼球取血，室温静置 2 h ， 3500 r/min 离心 10 min （离心半径 7.5 cm ），别离血清，按试剂盒阐明书测定血清中 IL-1β 及 TNF-α 水平。

　　取小鼠大脑安排固定于 4% 多聚甲醛中，惯例办法脱水、通明、浸蜡并包埋。取小鼠全脑蜡块切片（ 3 μm ），烘干后将切片放入二甲苯 Ⅰ 20 min 、二甲苯 Ⅱ 20 min 、无水乙醇 Ⅰ 5 min 、无水乙醇 Ⅱ 5 min 、 75% 乙醇 5 min ，水洗。甲苯胺蓝染色 45 min ，水洗， 0.1% 冰醋酸分解，水洗停止反响，显微镜下操控分解程度，水洗后置于 60 ℃烤箱烘干。切片于二甲苯通明 5 min ，中性树胶封片。置于显微镜下摄影，选用 Image-Pro Plus 6.0 软件进行图画剖析， IDO 法检测海马 CA3 区尼氏小体均匀吸光度（ A ）值。

　　取各组小鼠脑安排脱水、包埋、切片（约 3 μm ），切片惯例脱蜡至水，用柠檬酸缓冲液进行抗原修正。 PBS 溶液（ pH 7.4 ）洗刷后用组化笔画圈，在圈内参加自发荧光淬灭剂后流水冲刷。牛血清白蛋白关闭 30 min 后，滴加 PBS 制造的一抗，切片平放于湿盒内 4 ℃孵育过夜。 PBS 洗刷后滴加与一抗相应种属的二抗掩盖安排，避光室温孵育 50 min 。切片于荧光显微镜下调查并收集图画，运用 CaseViewer 4.0 扫描阅读软件选取安排的意图区域对海马 CA3 区进行成像，运用 Image J 软件剖析均匀荧光强度。

　　选用 SPSS 26.0 软件进行试验数据计算，以 标明，计量数据契合正态性散布的选用单因素方差剖析（ One-way ANOVA ）或 t 查验，不契合正态者则选用非参数查验法剖析。

　　3.1.1糖水偏好率 如表 1 所示，与对照组比较，模型组小鼠糖水偏好率显着下降（ P ＜ 0.05 ），提示动物快感缺失，出现郁闷样行为，标明造模成功。

　　与模型组比较，各给药组小鼠糖水偏好率显着升高（ P ＜ 0.01 ），标明荆芥挥发油能够改进模型小鼠快感缺失的行为反常体现，体现出抗郁闷效果。

　　3.1.2逼迫游水、悬尾试验不动时间及飞溅试验梳洗时间 如表 2 所示，与对照组比较，模型组小鼠游水及悬尾试验中的不动时间别离延伸（ P ＜ 0.05 ），飞溅试验中小鼠梳洗时间缩短（ P ＜ 0.01 ），标明 CUMS 模型小鼠出现行为学反常。与模型组比较，各给药组小鼠悬尾和逼迫游水试验中的不动时间显着缩短（ P ＜ 0.01 、 0.001 ），梳洗时间延伸（ P ＜ 0.05 ）。

　　如表 3 所示，与对照组比较，模型组小鼠血清 IL-1β 水平显着升高（ P ＜ 0.05 ）， TNF-α 呈升高趋势；与模型组比较，各给药组小鼠血清 IL-1β 水平显着下降（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）， TNF-α 呈下降趋势。

　　如图 1 所示，对照组小鼠海马神经元尼氏体丰厚，上色显着，摆放规整，神经元细胞形状结构较好。与对照组比较，模型组小鼠海马 CA3 区神经元细胞摆放欠安，细胞间空隙增宽，胞体多角形变小改动显着，海马神经元细胞舒展，胞质尼氏体数量削减。与模型组比较，各给药组海马 CA3 区神经元形状结构正常，胞质尼氏体丰厚呈蓝染颗粒状，染色比较明晰，摆放较为规整。如表 4 所示，与对照组比较，模型组尼氏小体数量显着削减（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，各给药组尼氏小体数量均显着添加（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），阐明荆芥挥发油能够经过发挥神经维护效果对立动物的郁闷样行为。

　　3.5荆芥挥发油对CUMS模型小鼠海马安排NLRP3/细胞焦亡通路相关蛋白表达的影响

　　传统中药挥发油（精油）依赖于其共同的芳香气味、易透过血脑屏障、多靶点、不良反响少等特色，经过抗焦虑、抗郁闷、冷静安神、神经维护等多种药理活性，在防治郁闷、焦虑等情志疾病上出现出共同优势 [13] 。荆芥挥发油作为荆芥的首要物质根底，已被证明具有杰出的抗炎、抗病毒、抗肿瘤、解热镇痛等效果[16] ，且前期研讨亦标明其抗炎效果与其对立LPS 所造成的的郁闷样模型小鼠行为学反常有关[12] ，因而究其抗郁闷效应，值得进一步探求。

　　CUMS 郁闷模型仿照了人类郁闷症的产生和发病机制，被以为是较为抱负的动物郁闷模型[17-20] 。触摸重复应激的动物糖水耗费会削减，出现快感缺少痕迹，因而糖水偏好试验可用于点评郁闷程度[21-22] 。 飞溅试验首要调查动物是否出现行为冷漠状况。本试验成果标明，CUMS 造模后，小鼠糖水偏好率下降，提示CUMS 郁闷模型构建成功。荆芥挥发油接连给药5 周，能显着提高糖水偏好率，显着缩短小鼠悬尾与逼迫游水试验中不动时间，延伸飞溅试验中的梳洗时间，结合小鼠行为失望郁闷模型的成果，标明荆芥挥发油具有抗郁闷效果。

　　近年来研讨以为，压力添加会引起外周和中枢神经体系中的促炎细胞因子开释，以及大脑中小胶质细胞的激活，特征体现为细胞外表标志物 Iba-1 的添加。IL-1β 和TNF-α 作为炎症介质在细胞信号传导中发挥重要效果，本身也会影响神经递质体系、大脑功用和心情[23] ，与郁闷症的产生、开展较为亲近[24] 。本研讨成果发现，CUMS 模型小鼠血清中炎症因子IL-1β 、TNF-α 水平升高，小鼠海马CA3 区Iba-1 蛋白表达上调，提示小胶质细胞被激活，荆芥挥发油则能显着对立上述改变，标明药物能按捺小胶质细胞激活，削减炎症因子开释，然后按捺神经炎症来发挥抗郁闷效果。当神经元长时间遭到应激或受损时，尼氏领会削减、崩溃乃至消失，常被用于评价神经元损害体现[25] 。与模型组小鼠比较，荆芥挥发油医治后能减轻小鼠海马CA3 区神经元形状病理体现，添加尼氏小体数目，提示药物对CUMS 造模导致的海马神经元损害有维护效果。

　　研讨以为，郁闷症的神经炎症反响病理机制与小胶质细胞功用改变、 Toll 样受体（Toll-like receptors ，TLRs ）以及NLRPs 等信号通路有关[26] ，其间NLRP3 炎症小体被证明参加了郁闷症的发病机制[27] 。NLRP3 作为炎症小体的中心蛋白，拼装ASC 和Caspase-1 构成NLRP3 炎症小体，NLRP3 炎症小体被激活后，cleaved Caspase-1 切开GSDMD 中N 端和C 端结构域之间的接头，然后N 端GSDMD 结构域片段易位到质膜构成膜孔，导致细胞裂解逝世或经过孔排泄老练状况的IL-1β 、IL-18 ，诱导一系列炎症反响，终究引起细胞焦亡[28-29] 。本研讨成果发现，CUMS 郁闷模型小鼠海马安排NLRP3 、ASC 、Caspase-1 、IL-1β 、pro IL-1β 蛋白表达水平显着上调，免疫荧光法相同标明NLRP3 、IL-1β 蛋白表达量添加，提示模型小鼠海马安排NLRP3 炎症小体被激活，致使炎症因子添加；进一步检测发现GSDMD 、N-GSDMD 、cleaved Caspase-1 表达量添加，提示出现细胞焦亡，然后导致神经元的损害。研讨成果也证明了郁闷症的产生与NLRP3 炎症小体激活、细胞焦亡产生亲近相关。荆芥挥发油医治后，上述蛋白的表达量均出现下调的体现，标明荆芥挥发油能经过按捺NLRP3 炎症小体激活及细胞焦亡产生，然后减轻神经损害来发挥抗郁闷效果。

　　综上，本研讨证明了荆芥挥发油的抗郁闷效果，并提示其抗郁闷效果与按捺 NLRP3 炎症小体激活及细胞焦亡、按捺小胶质细胞活化、下降炎症因子表达等有关。研讨成果丰厚并拓宽了荆芥挥发油杰出抗炎效果的运用根据，清晰了该挥发油的抗郁闷效果体现。

　　来 源：秦甜甜，黄如杨，谢红潇，胡靖文，曾九僧，刘 蓉，曾 南．根据NLRP3/细胞焦亡通路研讨荆芥挥发油的抗郁闷效果及效果机制 [J]. 中草药, 2023, 54(12):3878-3886.

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