南京中医药大学等：依据正交试验结合基准关联度和AHP-熵权法优化经典名方黄连汤提取工艺

　　经典名方黄连汤（ Huanglian Decoction ）出自《伤寒论》（东汉 · 张仲景），被收载于《古代经典名方目录（第一批）》 [1] 。全方由黄连、甘草（炙）、干姜、桂枝（去皮）、人参、半夏（洗）、大枣（擘） 7 味药组成，主治伤寒胸中有热，胃中有邪气，腹中痛，欲呕吐者 [2] 。现代黄连汤及其加减方常用于医治胃肠疾病、妇科疾病及其他疾病，效果显著 [3-4] 。 经典名方制剂研制是近年来中药新药研制热门。依据国家药品监督办理局发布《古代经典名方要害信息表（ 25 首丹方）（征求意见稿）》[5] 、 《按古代经典名方目录办理的中药复方制剂药学研讨技术指导准则（试行）》[6] （简称《准则》），制剂研讨应以制剂质量与基准样品质量根本共同为方针。但在现代大出产中，中试产品的质量易受提取办法、提取容器等很多要素的影响，难以完成现代提取工艺与传统制法的质量共同性。质量标志物（quality marker ，Q-Marker ）最早于2016 年由刘昌孝院士[7] 提出，经过危险点评、试验规划等手法确认出产工艺的要害质量特点、要害物料特点与要害工艺参数间的联络模型，进步工艺稳健性和产品质量可控性[8-9] 。基准关联度（standard relation ，SR ）可点评现代提取工艺下各样品与基准样品间质量的共同性，从而确认与传统工艺最挨近的现代工艺。层次剖析法（analytic hierarchy process ，AHP ）- 熵权法可确认各个测定目标的权重系数，将片面赋权法和客观赋权法结合，完成主客观内涵共同[10] ，使挑选出的现代提取工艺参数愈加科学可信。本研讨依据质量源于规划（quality by design ，QbD ）理念，核算不同提取参数的各种点评目标下各样品与基准样品的基准关联度，结合AHP- 熵权法对方中君臣佐使别离片面赋权，确认各点评目标的权重系数，以确保在所挑选的提取工艺参数下制备的样品与基准样品坚持质量共同，确保提取工艺安稳牢靠，为黄连汤的后续中试工艺和工业化出产供给科学依据。

　　Waters 2695 型高效液相色谱仪，装备四元泵、柱温箱、自动进样器、2998 检测器、Empower3 色谱作业站，美国Waters 公司；Milli-Q 型超纯水机，美国Millipore 公司；FA1104 型电子剖析天平，d ＝0.1 mg ，上海精细科学仪器有限公司；MS105DU 型电子剖析天平，d ＝0.01 mg ，瑞士梅特勒- 托利多公司；KQ-500E 型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；DHG-9140A 型电热恒温鼓风枯燥箱，上海精宏试验设备有限公司；AE-1106A 型多功能红外炉，中山市爱米日子电器有限公司。

　　对照品盐酸小檗碱（批号 11 ，质量分数86.7% ）、盐酸巴马汀（批号11 ，质量分数86.8% ）、盐酸黄连碱（批号11 ，质量分数95.1% ）、甘草苷（批号11 ，质量分数93.1% ）、甘草酸铵（批号11 ，质量分数97.7% ）、6- 姜辣素（批号11 ，质量分数99.9% ）均购自我国食品药品检定研讨院。 磷酸二氢钾，色谱级，上海阿拉丁生化科技有限公司；乙腈，色谱级，默克股份两合公司；甲醇，色谱级，江苏汉邦科技有限公司；磷酸，色谱级，上海阿拉丁生化科技有限公司；其他试剂为剖析级。 黄连（批号22041211 ）、干姜（批号22041811 ）、水炙甘草（批号22041311 ）、桂枝（批号22041511 ）、人参（批号22041711 ）、汤洗半夏（批号22042011 ）、大枣（批号22041711 ）均由威风药业集团有限公司供给，均经过南京中医药大学药学院陈建伟教授判定，黄连为毛茛科黄连属植物黄连Coptis chinensis Franch. 的枯燥根茎、干姜为姜科姜属植物姜Zingiber officinale Rosc. 的枯燥根茎、水炙甘草为豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的枯燥根和根茎、桂枝为樟科樟属植物肉桂Cinnamomum cassia Presl 的枯燥嫩枝、人参为五加科人参属植物人参Panax ginseng C. A. Mey. 的枯燥根和根茎、汤洗半夏为天南星科半夏属植物半夏Pinellia ternata Breit. 的枯燥块茎、大枣为鼠李科枣属植物枣Ziziphus jujuba Mill. 的枯燥老练果实，均契合《我国药典》2020 年版[11] 饮片规范。

　　对黄连汤煎煮工艺进行研讨，确认最佳工艺：称取黄连 41.40 g ，甘草（水炙）41.40 g ，干姜41.40 g ，桂枝41.40 g ，人参27.60 g ，半夏（汤洗）60.00 g ，大枣42.00 g 于砂锅中，加2000 mL 水，浸泡60 min ，以武火（2200 W ）煮沸后，调理火力至文火（900 W ）坚持微沸，煎煮约60 min 后，趁热滤过，滤液放凉后加水调整体积至1200 mL ，即得黄连汤基准样品。

　　精细量取黄连汤基准样品 10 mL 于安稳质量后的蒸发皿中，水浴蒸干后，105 ℃枯燥3 h ，记载质量，核算干膏率。

　　2.3.2办法学调查 [16] 参阅本课题组前期研讨根底进行，成果均满意剖析要求。

　　2.3.3 供试品溶液的制备 精细量取黄连汤基准样品及正交水提液2 mL 置10 mL 量瓶中，参加甲醇7 mL ，再加水至刻度，使甲醇体积分数为70% ，称定质量，超声处理30 min ，放冷，用70% 甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

　　2.3.4 指纹图谱的树立及其类似度剖析 别离取“2.3.3 ”项下办法制得基准样品供试品溶液及正交水提液供试品溶液，按“2.3.1 ”项下色谱条件进样，测定指纹图谱。将色谱成果以cdf. 的格局导入2012 年版《中药色谱指纹图谱类似度点评系统》进行点评。以基准样品的指纹图谱为参照图谱，时间窗宽度为0.1 s ，选用中位数法，进行全谱峰匹配，核算类似度。图谱见图1 。

　　2.4.2办法学调查[17] 参阅本课题组前期研讨根底进行，成果均满意剖析要求。

　　2.4.4 供试品溶液的制备 同“2.3.3 ”项下供试品溶液的制备办法。

　　取制得的基准样品，按“ 2.2 ”～“2.4 ”项下办法，平行制备2 份供试品溶液，测定黄连汤基准样品的干膏率及各目标成分含量，算取平均值。

　　2.6.1 加水量调查 顺次称取处方量的饮片于5 L 圆底烧瓶中，别离参加4 、6 、8 、10 、12 倍处方量的去离子水进行回流提取，别离浸泡60 min ，提取60 min 。按“2.3.3 ”项下办法平行制备2 份供试品溶液，测定水提液中黄连碱、巴马汀、小檗碱、6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸及干膏率，算取平均值，成果见表1 。跟着加水量添加，黄连碱、巴马汀、小檗碱、甘草苷、甘草酸含量及干膏率呈上升趋势，超越10 倍水后，6- 姜辣素含量下降。结合随性物质基准调查目标，加水量的低水平及高水平别离为6 倍量水和10 倍量水。

　　2.6.2 浸泡时间调查 顺次称取处方量的饮片于5 L 圆底烧瓶中，参加8 倍处方量的去离子水进行回流提取，别离浸泡20 、40 、60 、80 min ，提取60 min 。按“2.3.3 ”项下办法平行制备2 份供试品溶液，测定水提液中黄连碱、巴马汀、小檗碱、6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸及干膏率，算取平均值，成果见表2 。 跟着浸泡时间添加，黄连碱、巴马汀、小檗碱、 6- 姜辣素的含量呈缓慢上升趋势，超越 60 min 后，甘草 苷、甘草酸含量略有下降，干膏率无显着改变。因而，浸泡时间的低水平及高水平别离为 20 、60 min 。

　　2.6.3 提取时间调查 顺次称取处方量的饮片于5 L 圆底烧瓶中，参加8 倍处方量的去离子水进行回流提取，浸泡60 min ，别离提取30 、40 、50 、60 min 。按“2.3.3 ”项下办法平行制备2 份供试品溶液，测定水提液中黄连碱、巴马汀、小檗碱、6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸及干膏率，算取平均值，成果见表3 。跟着提取时间添加，黄连碱、巴马汀、小檗碱的含量和干膏率呈上升趋势，6- 姜辣素的含量无显着趋势，提取时间超越50 min 后，甘草苷上升缓慢且甘草酸含量下降。结合物质基准的各项目标，由此确认提取时间的低水平及高水平别离为30 、60 min 。

　　（1）要害质量特点（ critical quality attributes ， CQAs ）和要害工艺参数（ critical process parameters ， CPPs ）的确认：依据前期研讨，物质基准开始猜测黄 连碱、巴马汀、小檗碱、甘草苷、甘草酸、桂皮醛、 6- 姜辣素为黄连汤潜在的质量标志物（ Q-Marker ） [16] 。 因为桂皮醛在制剂中的浓缩、枯燥阶段损耗较大，故先提取桂枝挥发油，后用 β- 环糊精进行包合，在制粒环节参加颗粒中。因而，在提取正交试验中，挑选 6 个目标成分含量（黄连碱、巴马汀、小檗碱、甘草苷、甘草酸、 6- 姜辣素）、干膏率及指纹图谱类似度作为黄连汤提取工艺的 CQAs 。结合文献剖析，挑选料液比（ A ）、浸泡时间（ B ）、提取时间（ C ） 3 个要素作为黄连汤制剂工艺的 CPPs 。

　　（2）正交试验规划：称取与传统工艺相同处方量的同一批的药材饮片，共 9 份，以料液比（ A ）、浸泡时间（ B ）、提取时间（ C ） 3 个要素为调查目标，以提取物中黄连碱、巴马汀、小檗碱、 6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸含量，指纹图谱类似度以及干膏率为点评目标，按 L9(34) 正交表进行提取，检测成果见表 4 。

　　2.8.1 点评目标 的确认 基准关联度是点评某样品与基准样品的类似度的要害参数，应首要确认样品点评的目标数目 n 和样品数目 m ，本办法的根本路线 所示。本研讨将正交试验规划生成的 9 个样品与基准样品比较，以提取物中黄连碱、巴马汀、小檗碱、 6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸含量，指纹图谱类似度以及干膏率为点评目标，以 Xi ,j 、 Sj 为点评目标， Xi,j 表明正交试验的第 i （ i ＝ 1 ， 2 ， … ， m ）个样本的第 j （ j ＝ 1 ， 2 ， … ， n ）个目标下的测量值， Sj 表明基准样品的第 j （ j ＝ 1 ， 2 ， … ， n ）个目标下的测量值。

　　表 Xij 相对于 Sj 的误差越小，即该条件下制得样品 质量与基准样品类似度更高。依据公式（ 1 ）核算 RDij 。

　　2.8.3 基准关联度（ standard relation ， SRij ） 的核算 以基准样品质量为规范值（ S ），以正交试验规划下的各样品质量为测得值（ X ），以不同的目标为点评目标，按公式（ 2 ）核算所得成果，称为基准关联度，成果见表 5 。 SRij 表明第 i （ i ＝ 1 ， 2 ， … ， m ）个样本的第 j （ j ＝ 1 ， 2 ， … ， n ）个目标下的基准关联度。 SRij 越挨近 100% ，在该目标下的工艺参数制得的样品与基准样品类似度越高。

　　核算公式如公式（ 2 ）所示，核算成果表明，当以黄连碱、巴马汀、小檗碱、甘草苷、甘草酸为点评目标时，与基准样品最为挨近的是试验 8 ；当以 6- 姜辣素为点评目标时，与物质基准最为挨近的是试验 9 ；当以指纹图谱类似度为点评目标时，与物质基准最为挨近的是试验 6 ；当以干膏率为点评目标时，与物质基准最为挨近的是试验 1 。由此可得，当以单一要素为点评目标时，试验所得最优成果会依据点评目标的改变而改变，因而需进行归纳评分后才干确认提取工艺参数。

　　（1）构建判别矩阵：依据君臣佐使准则 [12] ，黄 连汤方中黄连和干姜为君药，黄连苦寒，清胸中之热、兼和胃气，干姜辛温，以温胃中之寒；臣药为桂枝和半夏，桂枝辛散温通、祛寒止痛，半夏和胃降逆止呕，宽胸散结消痞；佐药为人参和大枣，兼得益气健脾、平缓药性之效；使药为甘草，甘草甘平，缓腹中之痛 [13] 。诸药合用，可平调寒热、和胃降逆。

　　本研讨参阅《中药新药质量规范研讨技术指导准则（试行）》要求 [14] ，依据黄连汤的处方组成，结合各味药中目标性成分的实践测得性和安稳性，挑选君药黄连中的黄连碱、巴马汀、小檗碱，君药干姜中的 6- 姜辣素，以及使药甘草中的甘草苷、甘草酸为 6 个目标性成分，一起统筹干膏率和指纹图谱。经过干膏率反映提取工艺的安稳性，指纹图谱表现制剂进程中小分子成分的概括及定性特征。

　　指纹图谱可反映小分子成分概括和定性特质，但与含量测定的目标性成分比较，其所包括的质量信息仍较少 [15] ，故将其重要程度视为与干膏率同等重要。故按黄连碱＝巴马汀 = 小檗碱＞ 6- 姜辣素＞甘草苷＝甘草酸＞指纹图谱类似度≈干膏率的次序，再依据 AHP 理论判别矩阵 1 ～ 9 标度，对同一层次内 n 个目标的相对重要程度进行打分，成果见表 6 。黄连碱、巴马汀、小檗碱为君药黄连的首要药效成分，相对于 6- 姜辣素较显着重要，故标为 4 ，相对于甘草苷、甘草酸显着重要，故标为 5 ，相对于指纹图谱类似度和干膏率显着更为重要，标为 6 ，以此类推，依据公式（ 3 ）构建判别矩阵 A ，数据见表 7 ， 用 aef 表明要素 e 相对于要素 f 的比较成果。

　　（2）核算片面权重系数（ Wj S ）：首要对判别矩 阵 A 进行几何平均（方根法），按公式（ 4 ）核算得到初始权重系数（ Wj ′ ）， ajn 表明第 j （ j ＝ 1 ， 2 ， … ， n ）个目标要素对第 n （ n ＝ 1 ， 2 ， … ， j ）个目标要素的比较成果，然后依照公式（ 5 ）核算归一化 Wj S ，得到 5 个目标的 Wj S ，成果见表 8 。

　　（1）树立正交试验原始数据矩阵：现有 m 个样本， n 个点评目标，原始数据矩阵 R ＝ (Xi,j)m ×n ，以黄连碱、巴马汀、小檗碱、 6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸含量，指纹图谱类似度及干膏率 8 个目标为点评目标，树立原始数据矩阵（ R ）。

　　（2）将原始数据转化为概率矩阵：依据公式（ 8 ）将原始数据矩阵 R 转化为概率矩阵（ P ）， Pij 表明在第 j 个目标下第 i 个样本的概率。

　　2.9.3 归纳权重系数（ Wj ）的确认 选用 AHP 得到 Wj S ，熵权法得到 Wj O ，依据公式（ 11 ）核算各目标的 Wj ，成果见表 8 。

　　经过 AHP- 熵权法得到的 Wj ，可知黄 连碱占比 30% ，巴马汀占比 24% ，小檗碱占比 28% ， 6- 姜辣 素占比 5% ，甘草苷占比 5% ，甘草酸占比 6% ，干膏率占比 2% 。依据公式（ 12 ）核算归纳评分，成果见表 4 。由表 4 中成果可知，试验 8 归纳评分最高，成果表明与古法最类似的现代工艺参数为 A3B1C2 ，即以 6 倍量的水浸泡 1 h 煎煮 45 min 得到的样品与基准样品的质量最为共同。

　　对优化后的提取工艺参数进行验证，重复试验 3 次，测定黄连碱、巴马汀、小檗碱、 6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸含量，指纹图谱类似度及干膏率，核算归纳评分，成果见表 9 。验证试验的归纳评分均值为 90.11 ，与基准样品质量挨近，且契合《按古代经典名方目录办理的中药复方制剂药学研讨技术指导准则（试行）》 [6] 中对制剂出产研讨的要求。归纳评分的 RSD 值为 1.09% ，阐明该办法确认的提取工艺安稳牢靠且重复性杰出。

　　黄连汤作为平调寒热、和胃降逆治法的代表方，自古至今一向被很多医家广泛运用，对其进行经典名方制剂的开发研讨含义严重。课题组前期已依据古籍记载制备了黄连汤规范汤液，并树立了其质量 规范 [16-17] 。本研讨依据 QbD 理念，选用正交试验规划，树立以黄连碱、巴马汀、小檗碱、 6- 姜辣素、甘草苷、甘草酸、指纹图谱类似度和干膏率为主的质量操控系统，确认以加水倍量、浸泡时间、提取时间作为要害工艺参数，选用单要素试验确认各要素水平，运用正交规划优化经典名方黄连汤的提取工艺。 AHP 作为片面赋权法，由人为确认各个点评目标的权重系数，受人为影响较大；熵权法作为客观赋权法，依据数据改变规则得出终究权重系数，但不能表现中药复方的君臣佐使联络。

　　本研讨结合基准关联度和 AHP- 熵权法对质量点评系统进行赋权，清晰 8 个目标在质量操控系统中的权重系数，以此优化黄连汤现代提取工艺为加 6 倍量水、浸泡 60 min 、提取 45 min 。所得工艺可确保工业出产的可行性及产品质量的安稳性，契合经典名方“传承精华、古为今用、古今联接”的根本研讨准则，完成了传统工艺向现代工业出产的要害一步。

　　来 源：王晓丽，沈哲苑，李丽萍，梅 茜，何天雨，赵晓莉，毛 靖，侯金才，郭 勇，毛春芹，崔恩忠，陆兔林． 依据正交试验结合基准关联度和AHP-熵权法优化经典名方黄连汤提取工艺 [J]. 中草药, 2023, 54(15):4804-4811.

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